乌灵胶囊干预耳鸣模型大鼠听觉功能的变化及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1951

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (35): 5645-5651.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1951

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乌灵胶囊干预耳鸣模型大鼠听觉功能的变化及机制

磨宾宇1，韦韬2，李纪辉1，冯海燕1，陈美球1，韦玉梅1

(柳州市人民医院，1耳鼻咽喉科，2神经内科，广西壮族自治区柳州市 545006)

收稿日期:2019-06-04 出版日期:2019-12-18 发布日期:2019-12-18
通讯作者: 磨宾宇，柳州市人民医院耳鼻咽喉科，广西壮族自治区柳州市 545006
作者简介:磨宾宇，男，1980年生，汉族，广西壮族自治区人，2010年广西医科大学毕业，硕士，副主任医师。
基金资助:
广西中医药管理局科研课题(GZZC16-66)，项目负责人：李纪辉

Changes of auditory function and mechanisms in tinnitus rats treated by Wuling Capsule

Mo Binyu1, Wei Tao2, Li Jihui1, Feng Haiyan1, Chen Meiqiu1, Wei Yumei1

(1Department of Otorhinolaryngology, 2Department of Neurology, Liuzhou General Hospital, Liuzhou 545006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Received:2019-06-04 Online:2019-12-18 Published:2019-12-18
Contact: Mo Binyu, Department of Otorhinolaryngology, Liuzhou General Hospital, Liuzhou 545006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Mo Binyu, Master, Associate chief physician, Department of Otorhinolaryngology, Liuzhou General Hospital, Liuzhou 545006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Research Project of Administration of Traditional Chinese Medicine of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. GZZC16-66 (to LJH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
耳鸣：可归于传统中医学的“聊嗽”范畴，多属虚实夹杂之证，治疗应以补肾健脑，活血通窍为基本原则。
乌灵胶囊：是从乌灵参中提取的经过现代生物学技术提取纯中药制剂，成分为乌灵菌粉，具有养心安神、补肾健脑功效。

摘要
背景：临床目前尚无标准的治愈耳鸣方案。乌灵胶囊是从乌灵参中提取的经过现代生物学技术提取纯中药制剂，成分为乌灵菌粉，具有养心安神、补肾健脑功效。
目的：观察乌灵胶囊对耳鸣大鼠听觉功能的改善作用及其对听觉通路中神经元可塑性相关基因的影响。
方法：选取SPF级雄性Wistar大鼠75只，除正常组外，均采用饮水抑制法制备耳鸣大鼠模型，成功造模后模型组15只与正常组15只灌胃生理盐水，卡马西平组15只灌胃卡马西平药液，乌灵胶囊低、高剂量组各15只分别灌胃40，80 mg乌灵胶囊药液，持续给药4周。观察各组大鼠饮水抑制率Rb变化、旷场行为学变化、听性脑干反应阈值、初级听皮质病理、听皮质超微结构变化、听觉中枢的神经递质γ-氨基丁酸及5-羟色胺的水平变化和听皮质、耳蜗核、下丘及上橄榄核内可塑性相关基因表达。
结果与结论：①乌灵胶囊低、高剂量组及卡马西平组大鼠在条件反射消减期(7 d内)的反射抑制率Rb的均值显著低于模型组(P < 0.05)；②造模后第15天，模型组及各给药组的运动总行程、平均速度和直立次数均显著少于正常组，粪便粒数显著多于正常组(P < 0.05)，末次给药后，各给药组运动总行程、平均速度和直立次数均显著多于模型组，粪便粒数显著少于模型组(P < 0.05)；③与模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平显著增加(P < 0.05)，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠听皮质、下丘及耳蜗核内细胞骨架蛋白表达降低(P < 0.05)；④结果证实，乌灵胶囊显著减轻耳鸣大鼠听觉通路中神经元细胞的损伤程度，改善听觉中枢超微结构，降低听性脑干反应阈值，从而提高耳鸣大鼠的听觉功能，改善了焦虑、抑郁的情绪，其机制可能与提高下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平，改善耳鸣大鼠听觉通路中神经元可塑性相关基因的表达有关。实验已经柳州市人民医院医学伦理委员会批准(批准号：TRH58689)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2546-4816(磨宾宇)

关键词: 耳鸣, 听觉中枢超微结构, 听觉通路, 神经元可塑性相关基因, 乌灵胶囊, γ-氨基丁酸及5-羟色胺, 生长反应基因1, 神经生长相关蛋白, 细胞骨架蛋白

Abstract:

BACKGROUND: There is no standard cure for tinnitus. Wuling Capsule is a pure Chinese medicine preparation extracted from Wuling Ginseng by modern biological technology. Its composition is Wuling powder, which has the functions of nourishing the heart and calming the nerves, nourishing the kidney and strengthening the brain.
OBJECTIVE: To explore the effect of Wuling Capsule on the auditory function of tinnitus rats and its neuronal plasticity related genes in auditory central ultrastructure and auditory pathway.
METHODS: Seventy-five SPF-level Wistar rats were selected. In addition to the normal group, the other groups of rats were prepared with tinnitus model. After successful modeling, the model group (n=15) and the normal group (n=15) were given normal saline, and the carbamazepine group (n=15) was given carbamazepine solution. The low- and high-dose Wuling Capsule groups were intragastrically administered with 40 and 80 g of Wuling Capsule for 4 weeks. The changes of drinking water inhibition rate Rb, open field behavioral changes, auditory brainstem response threshold, primary auditory cortical pathology, auditory cortex ultrastructural changes, auditory central neurotransmitter γ-aminobutyric acid, 5-hydroxytryptamine were observed in the cortex, cochlear nucleus, inferior colliculus and upper olive.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The mean Rb in the high- and low-dose Wuling Capsule groups and the carbamazepine group in the conditioned reflex period (within 7 days) was significantly lower than that in the model group (P < 0.05). (2) On day 15 after modeling, the total stroke, average speed and erecting times in the model group and each drug-administered group were significantly lower than those in the normal control group, and the number of fecal pellets was significantly higher than that in the normal control group (P < 0.05). After the treatment, the total stroke, average speed and erecting times in the drug-administered groups were significantly higher than those in the model group, and the number of fecal pellets was significantly lower than that in the model group (P < 0.05). (3) Compared with the model group, the levels of γ-aminobutyric acid and 5-hydroxytryptamine in the hypothalamus were significantly increased (P < 0.05), and expression of cytoskeletal proteins in the auditory cortex, inferior colliculus and cochlear nucleus decreased in the low-and high-dose Wuling Capsule groups (P < 0.05). (4) These results indicate that Wuling Capsule significantly reduces the degree of neuronal damage in the auditory pathway of tinnitus rats, improves the ultrastructure of the auditory center, and lowers the auditory brainstem response threshold, thereby improving the auditory function of tinnitus rats and improving the anxiety and depression. The mechanism may be increasing the levels of γ-aminobutyric acid and 5-hydroxytryptamine in the hypothalamus and improving the expression of neuronal plasticity-related genes in the auditory pathway of tinnitus rats. The study was approved by the Ethical Committee of Liuzhou General Hospital, approval No. TRH58689.

Key words: tinnitus, auditory central ultrastructure, auditory pathway, neuronal plasticity related genes, Wuling Capsule, γ-aminobutyric acid, growth response gene-1, nerve growth related protein, cytoskeletal protein

中图分类号:

磨宾宇, 韦韬, 李纪辉, 冯海燕, 陈美球, 韦玉梅. 乌灵胶囊干预耳鸣模型大鼠听觉功能的变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(35): 5645-5651.

Mo Binyu, Wei Tao, Li Jihui, Feng Haiyan, Chen Meiqiu, Wei Yumei. Changes of auditory function and mechanisms in tinnitus rats treated by Wuling Capsule[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(35): 5645-5651.

图/表（结果） 7

2.1 动物数量分析大鼠75只，15只为正常组，实验期间均正常饮食水，无死亡；60只耳鸣模型组大鼠中，53只造模成功，其中，5只造模过程中死亡，2只顺应性较差造模不成功，造模成功率为88%。后期实验补充了模型大鼠7只，每组均为15只。

2.2 大鼠耳鸣情况乌灵胶囊低、高剂量组及卡马西平组大鼠在条件反射消减期(7 d内)的反射抑制率Rb的均值显著低于模型组(P < 0.05)。提示乌灵胶囊及卡马西平对水杨酸钠造成耳鸣的症状具有一定的改善作用，且乌灵胶囊组的Rb值恢复速度慢于卡马西平组，提示乌灵胶囊对耳鸣的改善作用优于卡马西平组，见图1。

2.3 各组大鼠旷场行为学变化实验前，各组大鼠的运动总行程、速度、直立次数、中央格停留时间及粪便数量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。造模后15 d，模型组及各给药组的运动总行程、平均速度和直立次数均显著少于正常组，粪便粒数显著多于正常组(P < 0.05)。治疗结束后，各给药组运动总行程、平均速度和直立次数均显著多于模型组，粪便粒数显著少于模型组(P < 0.05)，见表2。

2.4 不同声音刺激频率下各组大鼠ABR阈值情况和正常组相比，不同刺激频率下模型组大鼠ABR阈值上升；和模型组相比，不同刺激频率下卡马西平组及乌灵胶囊低、高剂量组大鼠ABR阈值显著降低(P < 0.05)，见表3。

2.5 各组大鼠大脑初级听皮质病理情况正常组大鼠神经元细胞紧密、规则排列；模型组大鼠神经元细胞分布不均匀，细胞膜为空泡状，毛细血管变形弯曲，部分细胞发生皱缩；乌灵胶囊低、高剂量组大鼠神经元细胞不同程度好转，且乌灵胶囊高剂量组大鼠改善效果最佳；卡马西平组大鼠神经元细胞受损改善情况不明显，见图2。

2.6 各组大鼠听皮质超微结构情况和正常组相比，模型组大鼠突触活性区长度、突触前囊泡、突触曲率、突触间隙及突触后致密区厚度增加；和模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠突触活性区长度、突触前囊泡、突触曲率、突触间隙及突触后致密区厚度显著降低(P < 0.05)，而卡马西平组听皮质突触参数改善不明显。详见表4，图3。

2.7 各组大鼠脑组织中γ-氨基丁酸及5-羟色胺的水平变化与正常组相比，模型组大鼠下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平显著降低(P < 0.05)。与模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平显著增加(P < 0.05)，而卡马西平组大鼠下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平水平变化不明显(P > 0.05)，见表5。

2.8 各组大鼠听觉通路中细胞骨架蛋白表达情况和正常组相比，模型组大鼠听皮质、下丘及耳蜗核内细胞骨架蛋白表达升高；和模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠听皮质、下丘及耳蜗核内细胞骨架蛋白表达降低(P < 0.05)，而卡马西平组听觉通路中细胞骨架蛋白表达改善不明显(P > 0.05)，见表6。

2.9 各组大鼠听觉通路中神经生长相关蛋白43表达情况和正常组相比，模型组大鼠听皮质、下丘内神经生长相关蛋白43表达升高，上橄榄核、耳蜗核内神经生长相关蛋白

43表达降低(P < 0.05)；和模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠听皮质、下丘内神经生长相关蛋白43表达降低，上橄榄核、耳蜗核内神经生长相关蛋白43表达显著升高 (P < 0.05)，而卡马西平组听觉通路中神经生长相关蛋白43表达改善不明显(P > 0.05)，见表7。

2.10 各组大鼠听觉通路中组织内生长反应基因1表达状况和正常组相比，模型组大鼠听皮质、下丘内组织内生长反应基因1表达升高，上橄榄核、耳蜗核内组织内生长反应基因1表达降低(P < 0.05)；和模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠听皮质、下丘内组织内生长反应基因1表达降低，上橄榄核、耳蜗核内组织内生长反应基因1表达升高 (P < 0.05)，而卡马西平组听觉通路中组织内生长反应基因1表达改善不明显(P > 0.05)，见表8。

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引言

研究发现，耳鸣的发生率为10%-18%，且好发于老年人群，严重影响患者的身心健康，部分患者可因耳鸣出现注意力无法集中、睡眠困难，甚至烦躁、焦虑、抑郁等负面心理问题，严重者还有自杀倾向^[1-4]。近年来，随着社会生活的飞速发展及人口老龄化进程的加剧，耳鸣的发生率逐年升高^[5]。目前，临床对耳鸣治疗基本原则为明确其病因、对症治疗，主要通过明确耳鸣患者信号来源并消除来缓解临床症状，但治疗难度较大，目前尚无标准的治愈耳鸣方案，因此，耳鸣成为耳科学临床急需解决的顽疾之一。

耳鸣可归于传统中医学的“聊嗽”范畴，多属虚实夹杂之证，治疗应以补肾健脑，活血通窍为基本原则。乌灵参为炭角菌科炭角菌属真菌黑柄炭角菌的菌核，是中国名贵中药材，《四川中药志》1979年版曰：其可“除湿镇惊，补心肾，利小便，止心悸，催乳；治失眠、衄血及产后失血等症”^[6]。乌灵胶囊是从乌灵参中提取的经过现代生物学技术提取纯中药制剂，成分为乌灵菌粉，具有养心安神，补肾健脑功效。研究表明，乌灵胶囊配合赵氏雷火灸治疗心肾不交型失眠具有良好的疗效，可显著改善心烦不寐，入睡困难，心悸多梦，伴头晕耳鸣及腰膝酸软等症状。同时，李纪辉等^[7]研究显示乌灵胶囊和鼓室内灌注地塞米松结合使用可有效避免耳鸣与睡眠障碍的恶性循环，减轻耳鸣症状，提升睡眠质量，有效率达到70%以上。

基于此，实验成功建立耳鸣大鼠模型，观察了乌灵胶囊对鸣大鼠听觉功能及其对听觉中枢超微结构及听觉通路中神经元可塑性相关基因的影响，为临床患者诊疗提供一些借鉴。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2017年5月至12月在柳州市人民医院完成。

1.3 材料 SPF级雄性Wistar大鼠75只，听性脑干反应监测两耳反应阈20-30 dB声压级、无中耳感染、耳郭反应灵敏，6周龄，许可证号：SCXK(川)2018-20，实验经柳州市人民医院医学伦理委员会批准(伦理批准号：TRH58689)。常规饲养1周后开始实验，大鼠分笼饲养于各频率声音均小于25 dB SPL的隔声动物房内，每个笼内5只，室温22-26 ℃，相对湿度55%-65%，昼夜循环，保持12 h光照，大鼠灌胃、添加饲料及换水等都有专人进行。

1.4 实验方法

1.4.1 耳鸣模型大鼠的建立在禁水两三天后，动物出现干渴现象且体质量降至原来的80%后开始实验，将大鼠置于保持周围环境中有持续55 dB SPL白噪声的特制的隔音室中进行饮水训练，当背景白噪声分别于第5，10，15，20，25分钟出现停止1 min时，动物舔水即从饮水嘴处给予48 V电击(220 V变24，36，48 V)，交流变直流变压器(上海天觉公司)每大鼠每天训练1次，每次30 min，逐渐形成即“声音出现-饮水开始，声音消失-饮水停止”的条件反射，当条件反射形成后训练停止，进入条件反射的消退期，每日大鼠剂量为350 mg/kg水杨酸钠(哈药集团制药总厂)腹腔注射，因此，当白噪声停止时，大鼠可误认耳鸣声是部分安全信号，条件反射消减过程较快，共进行为期15 d的造模。造模过程中，动物的饮水行为是非条件反射，饮水同时电刺激大鼠电击嘴部会抑制饮水动作，白噪声停止和电击嘴部的刺激多次交替进行，可形成抑制饮水反应的条件反射，即无白噪声时，大鼠也会中断饮水行为的抑制性条件反射。若Rb为0.5±0.1提示饮水抑制消减至正常情况的标准。

1.4.2 动物分组及给药随机选取15只大鼠作为正常组，其他60只建立大鼠耳鸣模型，造模成功后随机分为4组：模型组、乌灵胶囊低剂量组、乌灵胶囊高剂量组及卡马西平组，每组各15只。造模期间，当其他大鼠给予水杨酸钠腹腔注射时，正常组大鼠每天给予5 mL/kg生理盐水腹腔注射。造模成功后，依据人和动物剂量转换公式^[9](约为人服用计量的6.3倍)，模型组与正常组灌胃2 mL生理盐水，卡马西平组给予剂量为 5 mg/kg的卡马西平(上海中西三雄药业公司)灌胃，乌灵胶囊低、高剂量组分别给予乌灵胶囊(规格：0.33 g，9粒/板，3板/盒，浙江佐力药业公司，国药准字Z19990048)40，80 mg灌胃，给药体积均为2 mL，每日1次，持续给药4周。

1.4.3 大鼠的行为学检测分别于造模前、造模后7 d及治疗期间每日均检测大鼠的饮水抑制率Rb变化，观察造模情况。

1.4.4 旷场行为学测量末次给药后，采用Elliott等^[10]报道的方法进行旷场实验，检测各组大鼠的抑郁焦虑行为，选择1个背景为黑色的矿场，大小约120 cm×90 cm×35 cm，底部需划分成9个方格，大小一致，分别于造模前1 d、造模后15 d及治疗后在位于中央的格子处于每日上午8：00-12：00观察大鼠的行为变化，注意保持环境安静、温度适宜。采用动物行为自动跟踪系统记录大鼠在旷场内的行为学变化，包括10 min内的总行程、平均速度、直立次数、中央格停留时间及粪便粒数。每次检测均将大鼠放置于中央的格子处观察，检测完毕后清理粪便，并消毒。

1.4.5 检测各组大鼠听性脑干反应(ABR)阈值变化末次给药后，各组大鼠腹腔注射剂量为0.8 μL/g的体积分数2.4%水合氯醛麻醉并放置在固定架上，大鼠耳间线中点颅顶皮下插入电极，声耳乳突皮下插入记录电极，鼻尖处插入地线，极间电阻与电极阻抗均低于5 kW，使用美国TDT公司的SigGrnRP系统单耳给声并收集信号，刺激声分别是4，12，20及28 kHz，强度在5-80 SPL，其声强衰弱间隔为5 dBNHL，维持10 ms，ABR阈值为引出可辨认Ⅱ波最小阈值。

1.4.6 各组大鼠初级听皮质病理情况末次给药后，大鼠麻醉后断颈处死，取脑放置在冰板内，选取大鼠颅脑表面人字缝、人字点及前卤点等解剖标志点同时确定其大脑对应位置，对初级听皮质位置确认，并将初级听力皮质切取，缓冲液冲洗后体积分数10%甲醛固定，而后行乙醇梯度脱水、透明，石蜡包埋后切片，常规行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察其病理情况。

1.4.7 透射电镜观察取大鼠两侧听皮质，采用体积分数2%戊二醛PBS固定，透射电镜(日本Jeol公司)观察各组大鼠听皮质超微结构情况，包含突触活性区长度、突触前囊泡、突触曲率、突触后致密区及突触间隙，突触曲率=突触界面弧长/突触界面弦长。

1.4.8 听觉中枢的神经递质γ-氨基丁酸及5-羟色胺的水平变化治疗结束后，切取大鼠下丘脑组织，采用预冷的PBS稀释研磨，并离心，吸取上清液，采用ELISA法检测各组大鼠脑组织中γ-氨基丁酸及5-羟色胺的水平变化，试剂盒购自南京建成生物研究所，具体步骤依据试剂盒说明书进行，酶标仪(美国Bio-Rad公司)读取吸光值。

1.4.9 检测各组大鼠听皮质、耳蜗核、下丘及上橄榄核内可塑性改变相关基因的表达末次给药后，大鼠麻醉断颈处死后取大鼠脑组织，依据脑立体定位图谱依次切取耳蜗核、听皮质、上橄榄核及下丘脑组织，实时荧光定量PCR检测各组织内生长反应基因1、神经生长相关蛋白43、细胞骨架蛋白相对表达状况，Trizol法提取总RNA行PCR扩增，引物信息见表1。采用相对表达量分析基因表达，采用GAPDH当做管家基因，基因表达结果以靶标和管家基因比值表示，反应结束后确定Real Time PCR扩增曲线与溶解曲线分析，确定引物扩增特异性和扩增效率。

1.5 主要观察指标各组大鼠旷场行为学变化，听皮质超微结构，大脑初级听皮质病理变化，不同声音刺激频率下各组大鼠ABR阈值，脑组织中γ-氨基丁酸及5-羟色胺的水平变化，听皮质、耳蜗核、下丘及上橄榄核内可塑性改变相关基因(组织内生长反应基因1、神经生长相关蛋白43及细胞骨架蛋白)表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以x(_)±s表示，多组件数据差异的比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验，P < 0.05差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

传统中医学认为耳鸣的发生与肾脏亏虚密切相关，肾为先天之本，主骨生髓，上通于脑，开窍于耳，肾精充实则气血生，气血运行健旺，上行充养耳窍，若外感六淫邪气上扰耳窍，加之肾脏亏虚，肾精气血不足无以充养耳窍，日久可造成气滞血瘀，发为耳鸣，故治疗应以补肾益精为主要治疗原则。乌灵胶囊是乌灵菌粉，包含γ-氨基丁酸、腺苷、谷氨酸及多糖等19种氨基酸，同时，含有多种微量元素与维生素，具有补肾健脑，养心安神的功效^[9-11]。实验结果显示，和正常组相比，模型组的消退期明显缩短，大鼠ABR阈值显著上升，初级听皮质病理状况显示神经元细胞分布不均匀，细胞膜为空泡状，毛细血管变形弯曲，部分细胞发生皱缩，透射电镜结果显示突触活性区长度、突触前囊泡、突触曲率、突触间隙及突触后致密区厚度增加，旷场行为学检测显示，造模后第15天，模型组及各给药组的运动总行程、平均速度和直立次数均显著少于正常组，粪便粒数显著多于正常组。提示耳鸣大鼠模型造模成功，大鼠出现了耳鸣症状，并通过旷场行为学检测显示耳鸣症状抑制了大鼠的探索性、兴奋性及运动性功能。而给予乌灵胶囊治疗后，大鼠的消退期显著降低，神经元细胞损伤程度亦出现不同程度的好转，旷场行为学指标也得到了显著的改善，提示乌灵胶囊可显著减轻耳鸣大鼠听觉通路中神经元细胞的损伤程度，改善听觉中枢超微结构，降低ABR阈值，从而提高耳鸣大鼠的听觉功能，提高了大鼠的行为能力，改善了焦虑、抑郁的情绪。

目前，学者认为听觉中枢神经元的可塑性改变与耳鸣的病理过程密切相关^[12-14]。在外界因素的刺激下，中枢神经系统代偿外周神经输入的减少，导致兴奋性神经递质及其受体的含量，或负调节抑制性神经递质及其受体的含量显著增加，听觉皮质的自发放电活动也相应的增加，最终导致耳鸣相关活动的增加^[15-17]。γ-氨基丁酸是常见的抑制性神经递质，参与了下丘脑的声音频率分析、时间和空间编码的生理过程。当下丘脑γ-氨基丁酸介导的抑制性神经活动降低，可导致听皮质的兴奋，同时，听觉通路上各级神经元的γ-氨基丁酸结合位点数量亦相应显著减少，导致γ-氨基丁酸受体结合特性亦发生变化，从而引起了神经元可塑性的变化，耳鸣发生^[18-20]。5-羟色胺能神经元的神经纤维末梢多存在于中枢神经系统的听觉核团中，在神经觉察方面发挥重要作用^[21]。研究发现，5-羟色胺能显著升高大鼠下丘脑γ-氨基丁酸能自发神经突触后电流，提高一些神经元诱发的活动水平，因此，认为5-羟色胺也是造成了神经元的可塑性变化的重要因素，是耳鸣产生的一个重要病理环节^[22-23]。相关研究显示，乌灵菌粉对抑制性神经递质γ-氨基丁酸与脑内谷氨酸含量有调控作用，从而起到中枢镇静影响的作用^[24，25]。实验结果显示，与模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平显著增加，提示乌灵胶囊可提高下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平，发挥抑制作用，促进神经元异常放电的恢复，改善耳鸣症状。

细胞骨架蛋白和组织内生长反应基因1都属于即刻早期基因家族，有研究最早由海马内分离中一些即刻早期基因^[26]，还可称作快速基因，被认为是一种受到生长因子或者神经递质、强突触刺激可能够快速、短暂激活基因。早期基因编码蛋白质可以当做转导因子，对蛋白产物和后期基因表达有调控作用，并介导神经重塑内稳定变化^[27-30]。目前，人们普遍认为细胞骨架蛋白能够当做活性神经元标记，参与维持突触可塑性。神经元受到刺激后5 min就显示细胞骨架蛋白mRNA增大，且可保持8 h以上。细胞骨架蛋白还能够对AMPA受体运输功能起调节作用，而对于调节AMPA受体胞吐作用与内吞作用为很多大脑区域内突触可塑性基础。组织内生长反应基因1表达受多种因素调节，若细胞受到肿瘤、应激、离子射线、细胞内毒素等会造成膜去极化，休眠状态下的组织内生长反应基因1被迅速激活，细胞从G₀期进入到G₁期，引起细胞增殖，组织内生长反应基因1基因在调节细胞分化、生长及细胞周期方面有重要影响。有研究对豚鼠和小鼠持续注射2周水杨酸钠后显示，动物畸变产物耳声发射升高，且耳蜗内组织内生长反应基因1表达量为空白组的9.85倍，说明组织内生长反应基因1和机体停聚中枢的神经元活性联系紧密。神经生长相关蛋白43为和突触重建、轴突再生及神经发育联系紧密一种快速转运包膜磷酸蛋白，能够当做神经再生标志。成年大鼠机体内，迷走神经背复合体质量神经生长相关蛋白43高水平表达利于突触可塑性和活性结构重组。实验显示，和模型组相比，乌灵胶囊低、高剂量组大鼠听皮质、下丘内组织内生长反应基因1、神经生长相关蛋白43表达降低，上橄榄核、耳蜗核内组织内生长反应基因1、神经生长相关蛋白43表达升高，且大鼠听皮质、下丘及耳蜗核内细胞骨架蛋白表达降低，提示乌灵胶囊可能通过调节神经元相关基因组织内生长反应基因1、神经生长相关蛋白43及细胞骨架蛋白的表达，来改善大鼠耳鸣症状的。

综上所述，乌灵胶囊显著减轻耳鸣大鼠听觉通路中神经元细胞的损伤程度，改善听觉中枢超微结构，降低ABR阈值，从而提高耳鸣大鼠的听觉功能，改善了焦虑、抑郁的情绪，其机制可能与提高下丘脑γ-氨基丁酸及5-羟色胺水平，改善耳鸣大鼠听觉通路中神经元可塑性相关基因的表达有关，丰富了耳鸣治疗的基础研究，为临床研究提供了一定的参考价值。但由于人力和时间等条件限制，实验对耳鸣大鼠具体治疗机制还未完全阐明，在今后还需进一步深入学习相关理论知识，以便进行更深入探究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

乌灵胶囊干预耳鸣模型大鼠听觉功能的变化及机制

Changes of auditory function and mechanisms in tinnitus rats treated by Wuling Capsule

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